非洛地平美托洛尔复方透皮贴剂的制备及其在兔体内药动学研

　　摘要:目的　制备非洛地平-美托洛尔复方透皮贴剂,研究其经家兔皮肤给药的药动学。方法　健康新西兰白兔6只, 3剂量3 周期随机交叉单次给予低、中、高3种不同剂量的非洛地平-美托洛尔复方透皮贴剂,其中非洛地平/美托洛尔剂量分别为: 1/ 10, 3/30, 9/90 mg·kg-1/mg·kg-1,剂间间隔为2周,给药时间为48 h。分别于给药后60 h内多点取静脉血;用气相色谱-电子捕获法分别测定血浆中非洛地平和美托洛尔的浓度。用DAS软件计算药动学参数并评价不同剂量组间的参数差异和贴剂的体内作用特征。结果　贴剂缓释特征明显,血药浓度稳定持久。经皮给药后低、中、高3种剂量组间非洛地平和美托洛尔的 ρmax、AUC0→60和AUC0→∞均有显著性差异(P<0·05),且ρmax和AUC0→∞均与剂量(D)呈良好的线性关系(P<0·05),非洛地平的回归方程为ρmax=6·634 2D+4·355(r2=0·993 8)和AUC0→∞=295·08D+92·322(r2=0·992 6),美托洛尔的回归方程为 ρmax=8·462 8D+51·528(r2=0·991 4)和AUC0→∞=315·14D+1 474·8(r2=0·998 7);两药的tmax,MAT,MRT0→60和MRT0→∞均无显著性差异(P>0·05),tmax均较长,分别为(21·50±8·14) ~(27·00±12·30)h和(25·33±14·40) ~(37·50±9·99)h, MRT0→∞均较长且相近,分别为(28·48±2·71)~(31·80±0·85) h和(28·09±4·41)~(31·79±1·29)h。结论　非洛地平-美托洛尔复方透皮贴剂缓释长效的药动学特征明确而稳定,达到了预期较长时间维持平稳有效血药浓度、提高药物生物利用度、减少服药频次、降低毒副作用的设计目的。

　关键词:非洛地平;美托洛尔;透皮贴剂;药动学

　非洛地平( felodipine, FEL)和美托洛尔(meto- prolo,lMET)均为目前临床治疗高血压的一线药物。 FEL为二氢吡啶类钙拮抗剂,可减小外周阻力,MET 为β1-受体阻滞剂,可降低心率,减少心输出量。两药联用治疗高血压有协同和累加作用,并可中和彼此触发的反调节机制:FEL逆转MET引起的外周血管收缩并防止心率过缓,MET消除FEL所致心率加快,其小剂量联用疗效和安全性显著优于单一用药, 且有利于兼顾患者存在的多种危险因素与并存疾病[1-2]。FEL和MET联用治疗高血压和稳定型心绞痛等心血管疾病的疗效已得到广泛认可和长期应用。最新研究结果表明[3],FEL和MET以缓释最小剂量(2·5mg/25mg)口服联用与单用最大剂量FEL 20 mg或MET 400 mg的降压效果相当,不良反应显著降低。其复方口服缓释片(Logimax()血压控制率达70%以上,在国外已成为高血压病的一线治疗药,国内多为单方制剂联用。但FEL和MET均有较强的肝脏首关效应,生物利用度分别仅为 15% ~25%[4]和30% ~40%[5],口服治疗效果差、血压控制不理想。透皮给药系统( transdermal drug delivery system,TDDS)是高血压药物治疗的最佳剂型,将FEL和MET制成复方透皮贴剂(transdermal patch)可避免肝脏首关效应,提高生物利用度(两药较口服灌胃液的相对生物利用度分别为275·37% 和189·76% );维持稳定持久的有效血药浓度;方便用药,减少用药剂量和服药频次;降低不良反应,提高治疗安全性和患者依从性,从而进一步加强联合用药的治疗效果。抗高血压药物联用经皮给药的研究国内外均未见报道。本实验成功制备了以压敏胶同时作为药物储库骨架和黏附层的FEL-MET复方透皮贴剂,并对其进行了兔体内药动学研究,考察与评价其体内作用特征。

　 1　材料与仪器

　1·1　试药与试剂

　非洛地平和酒石酸美托洛尔对照品(纯度均> 99·9%,AstraZeneca无锡制药有限公司赠送);尼莫地平对照品(nimodipine,NIM,纯度>99·5%,浙江正大青春宝药业有限公司赠送);富马酸比索洛尔对照品(bisoprolol Fumarate, BIS,批号: 200207001, 纯度>99·5%,军事医学科学院毒物药物研究所); 非洛地平原料药(批号: 200402001,含量: 99·0% ~ 101·0%,台湾永光化学工业股份有限公司);酒石酸美托洛尔原料药(批号: 040513,含量: 99·0% ~ 101·0%,上海定康药业);聚丙烯酸树脂(EudragitE PO和EudragitRL PO,药用,德国Rühm公司);月桂氮酮(药用,北京化学试剂公司);桉叶油醇(国药集团化学试剂有限公司);丙二醇(药用,北京化学试剂公司);聚乙二醇400(PEG 400,药用,北京化学试剂公司);琥珀酸(北京市金龙化学试剂有限公司); 0·9%生理盐水(北京双鹤药业股份有限公司);七氟丁酸酐(美国AlfaAesar公司);色谱纯甲苯、四氢呋喃(美国Fisher公司);水为超纯水;其余试剂均为市售分析纯,乙醚、正己烷、环己烷均经重蒸馏处理。

　1·2　仪器

　Agilent6890N型气相色谱仪和微池电子捕获检测器(美国Agilent科技公司); HERAEUS BIOFUGE 15R型台式高速冷冻离心机(德国Herae- us公司);Milli-Q超纯水制备仪(美国Millipore公司);XMTD型氮吹仪(余姚明伟仪表厂)。

　1·3　实验动物新西兰白兔6只,雌雄兼用(3·0±0·2)kg[解放军总医院医学实验动物中心,合格证号: SCSK- (京)2002-0005]。

　2　方法与结果

　2·1　FEL-MET复方透皮贴剂的制备

　采用流涎工艺[6]。取聚丙烯酸树脂EudragitE PO和EudragitRL PO适量(质量比为1∶1),加入丙酮、异丙醇和无水乙醇构成的复合有机溶媒,搅拌至澄明胶液;另取适量FEL和MET溶于复合有机溶媒,搅拌下依次加入处方量氮酮、桉叶油醇、丙二醇、 PEG 400和琥珀酸,得透明药液,合并两种溶液,混匀至澄清。超声脱气15min,于45℃下涂布于面积为30 cm2模具固定的复合铝塑膜上,室温干燥3 h, 置电热恒温鼓风干燥箱70℃固化0·5 h,取出,冷至室温,脱模,叠合保护膜,切割,即得药物含量约为 FEL 1 mg/MET 10 mg·cm-2的贴剂。

　2·2　FEL和MET血药浓度测定方法

　2·2·1　血浆样品预处理[7-8]　以GC-ECD内标法分别测定FEL和MET血药浓度。取血浆0·3 mL,置离心管中,加0·1 mg·L-1的NIM内标液30μL及 0·5 mol·L-1氢氧化钠溶液30μL混匀,加乙醚-正己烷(2∶1)2 mL分2次提取,涡旋6 min, 3 000 r· min-1离心10 min,移取合并上层有机相, 40℃下氮气吹干,以甲苯50μL复溶,涡旋1 min, 10 000 r· min-1离心10 min,取上清液进样测定血浆中FEL 含量。另取血浆0·3 mL,加5 mg·L-1的BIS内标液30μL,同上述操作碱化、提取、挥干,加入环己烷-四氢呋喃(10∶1)30μL,七氟丁酸酐12μL,密闭振摇,置40℃下反应40 min后氮气吹干,以甲苯50 μL复溶,涡旋,离心,取上清液进样测定血浆中 MET含量。

　2·2·2　色谱条件与方法专属性　色谱柱为HP-5 型气相色谱石英毛细管柱(Agilent 19091J-413, 5% PhenylMethyl Siloxane, 0·25μm×30·0 m, 320 μm);载气和补充气均为高纯氮气(≥99·99% );均采用不分流进样,进样口温度为270℃,检测器温度为300℃。检测FEL采用非程序升温, 250℃保持 12 min;检测MET采用程序升温,初始温度160℃, 保持2 min,后以15℃·min-1的速度升至240℃, 保持15 min;进样量均为3μL。在该色谱条件下, 药物与各自内标峰形良好,血浆内源性杂质对测定无干扰,样品峰与杂质峰分离度均大于2,理论塔板数均大于3 000; FEL和NIM的保留时间分别为 9·79和17·42 min;MET和BIS的保留时间分别为 6·35和5·78 min。见图1。

　2·2·3　标准曲线与检测限　取6份0·6 mL空白血浆,分别精密量取并依次对应加入不同浓度不同体积FEL和MET标准工作液,同时含FEL/MET系列浓度: 0·5/10, 2/50, 10/250, 20/1 000, 40/1 500和 80/2 500μg·L-1/μg·L-1的血浆样品,平均分成2 份,按“2·3·1”;项下方法分别处理后测定。以药物与各自内标峰面积之比(y)对样品质量浓度(ρ)作加权最小二乘法做线性回归,权重因子为1/C2。 FEL和MET的标准曲线方程分别为y=0·265 6+ 0·055 4ρ(r=0·999 7, n=5)和y=-0·008 6+ 0·00 3ρ(r=0·999 8,n=5),线性范围分别为0·5~ 80μg·L-1和10~2 500μg·L-1;最低定量限分别为0·15和0·3μg·L-1(S/N≥10);最低检测浓度分别为0·05和0·1μg·L-1(S/N≥3)。

　2·2·4　回收率与精密度　精密配制同时含有FEL 和MET高(80和2 500μg·L-1)、中(20和1 000 μg·L-1)、低(0·5和10μg·L-1)浓度的血浆样品,按“2·3·1”;项下方法分别处理后,于同一天内测定5次,连续测定5 d,得FEL和MET的方法回收率分别为97·42% ~99·74%和99·74% ~101·52%, RSD均小于10% (n=5);以血浆样品经处理后测得对照品峰面积与未经提取标样对照品峰面积相比, 得FEL, MET, NIM和BIS的提取回收率均大于 85%,RSD均小于10% (n=5)。

　2·2·5　样品稳定性　精密配制“2·2·4”;高、中、低3 种质量浓度的混合对照品血浆,分别置室温、 -20℃和3个冻融循环条件下储存,按“2·3·1”;项下方法分别处理后测定。结果表明,血浆样品在室温和-20℃条件下可分别保持12 h和30 d稳定, 经3个冻融循环后稳定性良好。本实验建立的GC- ECD分析方法专属性强、灵敏度高、准确性和重现性好,能够满足血浆中FEL和MET检测分析的要求。

　2·3　FEL-MET复方透皮贴剂在兔体内药动学研究

　2·3·1　实验剂量　分低、中、高3个剂量组对FEL- MET复方透皮贴剂进行药动学实验,分别为: FEL 1 mg·kg-1/MET 10mg·kg-1、FEL 3mg·kg-1/MET 30mg·kg-1和FEL 9mg·kg-1/MET90mg·kg-1。

　2·3·2　给药方案与血样采集　采用随机交叉自身对照实验。新西兰白兔6只,随机分为3组,每组2 只。给药前2 d以电动剃毛刀除去腹部毛,用8% Na2S溶液处理皮肤,生理盐水洗净,饲养待用。给药前禁食16 h。给药时于腹部剃毛区紧密贴敷贴剂,其边缘以宽胶带加固贴于皮肤,防止因动物躯体扭动剐蹭而致脱落,贴敷时间48 h,洗净期2周,分 3个周期交叉给药。分别于给药前和给药后2, 4, 8, 12, 18, 21, 24, 36, 48, 50, 52, 54, 60 h从耳缘静脉取血1·2 mL,全血样品均经肝素抗凝,立即置5 000 ··min-1离心10 min,分取血浆0·6 mL,置-20℃ 保存待测。