高效液相色谱法测定跌打活络微乳中蛇床子素的含量

　               作者：王利胜 占建坤 周莉玲

　 【关键词】  高效液相色谱

　摘要：目的建立跌打活络微乳中蛇床子素含量的测定方法。方法采用高效液相色谱法，色谱柱：Diamonsil钻石C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：甲醇水（80∶20），检测波长：322 nm；流速：1 ml/min。结果蛇床子素在0.042~ 0.336 μg线性关系良好，r=0.999 7，平均回收率为100.91%，RSD为2.42%(n=6)。结论该法操作简便，结果准确，灵敏度高，重现性好，可用于该制剂的质量控制。

　关键词：跌打活络微乳；高效液相色谱法；蛇床子素

　　                         

　　Determination of Osthole in Dieda Huoluo Microemulsions by HPLC

　Abstract：ObjectiveTo establish the determination method for osthole in Dieda Huoluo Microemulsions. MethodsHPLC was used with DiamonsilC18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), detection wavelength at 322 nm, mobile phase: methanol-water (80∶20), flow rate: 1ml/min. ResultsOsthole has good linear relationship between 0.042~0.336 μg, r=0.999 7, the recovery of osthole was 100.91% and RSD was 2.42% (n=6). ConclusionThe method is simple, sensitive and reliable to carry out to control the quality of this preparation.

　Key words：Dieda Huoluo Microemulsions; HPLC; Osthole

　跌打活络膏是由蛇床子、红花、大黄等几味中药材制成，具有活血化瘀、消肿止痛、收敛生肌、舒筋活络的功效，临床用于治疗跌打损伤、水火伤烫伤、扭伤、挫伤、瘀血疼痛等疗效显著。为了提高疗效，便于患者使用，根据各药材的性质、原制法及作用特点，采用超临界萃取技术提取药材中的有效部位，与处方中的挥发油组成油相，并制成O/W型微乳。蛇床子为处方中主要药物之一，蛇床子素为蛇床子的生物活性成分［1］，为了控制跌打活络微乳的质量，保证药品的质量及临床疗效，本文建立了高效液相色谱法测定蛇床子素含量的方法。

　 1 仪器与试药

　戴安summit P680高效液相色谱仪，summit P680A低压四元泵，PDA100二极管阵列检测器，ASI100自动进样器，summit柱温箱，Chromeleon色谱工作站；Shimadzu Libror AEL 40SM(十万分之一)天平（日本岛津所）；Aquapro实验室级台式超纯化水机（重庆颐洋企业发展公司）。

　甲醇（色谱纯）；水（超纯水，临用前制备）；蛇床子素（中国药品生物制品检定所提供，含量测定用，批号：0822200204，纯度检查为99.7%)；其它试剂均为分析纯。

　 2 方法与结果

　2.1 色谱条件与系统适应性实验色谱柱：Diamonsil钻石C18 5 μm，250 mm×4.6 mm色谱柱；柱温：25℃；流动相：甲醇水(80∶20)；检测波长：322 nm［2］；流速：1 ml/min；进样量：10μl。在选定色谱条件下，测得蛇床子素对照品的保留时间约10.3 min；供试品色谱中蛇床子素峰与杂峰分离效果良好，分离度大于2.0；理论塔板数按蛇床子素峰计算应不小于3 000；阴性对照色谱在相应位置上无干扰峰。见图1。

　2.2 对照品溶液的制备  精密称取蛇床子素对照品10.5 mg于25 ml的棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释到刻度，制成0.42 mg/ml的蛇床子素对照品储备液；再精密吸取此液1 ml至25 ml的棕色量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，得0.016 8 mg/ml的蛇床子素对照品溶液。

　2.3 供试品溶液、阴性对照溶液的制备精密量取本品2 ml至10 ml的棕色量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜0.45μm滤过，取续滤液，即得。另按处方比例和样品制备工艺制成不含蛇床子的阴性微乳，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。

　2.4  线性范围的考察

　精密吸取蛇床子素对照品储备液0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0 ml置25 ml的棕色量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀；分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，以峰面积(mAU・min)为纵坐标，进行回归处理，得标准曲线方程：Y=49.75X＋0.387 3，r=0.999 7；结果表明在0.042~0.336 μg范围内，蛇床子素的峰面积与进样量呈良好线形关系。

　2.5 最低检出限实验　

　在本色谱条件下，使蛇床子素峰高为仪器响应噪声的3倍高，测得蛇床子素的最低检出量约为0.1  mg。

　2.6 精密度与稳定性实验　

　精密吸取上述对照品溶液（浓度：0.016 8 mg/ml）10 μl，重复进样6次。依法测定蛇床子素的峰面积，计算RSD= 0.26%，说明仪器的精密度良好；另取同一供试品溶液在12 h内，每相隔2h进样，依法测定蛇床子素的峰面积，计算RSD=0.84%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

　2.7 重现性实验分别精密称取同一批样品5份，按供试品溶液的制备方法配制，依法测定，计算蛇床子素含量，RSD=1.83%，测定结果说明，蛇床子素含量测定结果重现性良好。

　2.8  加样回收率实验精密量取6份含量为0.103 mg/ml的本品1ml容量瓶中，精密梯度加入蛇床子素对照品溶液（浓度：0.105 mg/ml），按含量测定项下的条件和方法测定，计算回收率，结果见表1。表1 回收率实验结果样品量（略）

　2.9 样品测定

　取3批样品，按供试品溶液的制备方法配制，依法测定蛇床子素的含量，结果见表2。表2 样品中蛇床子素含量测定（略）

　2.10 浸膏测定取2.9项下的同批样品的浸膏，称取1/10处方量的浸膏重量，用无水乙醇溶解并稀释至100 ml。精密量取2  ml至10 ml的棕色量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜0.45μm滤过，取续滤液，即得浸膏的供试品溶液。精密吸取10 μl进样，测定蛇床子素的含量，结果见表3。表3 浸膏中蛇床子素含量测定（略）

　 3  讨论