用化学发光微粒子免疫法研究甲钴胺在人体内的药动学和生物

　　摘要:目的　建立甲钴胺人体内血药浓度的化学发光微粒子免疫测定方法,并对口服甲钴胺制剂后人体内的药动学和生物等效性进行研究。方法　采用本试验建立的化学发光微粒子免疫法测定血清中甲钴胺的浓度,并对20名健康受试者口服单剂量1 500μg甲钴胺胶囊后的试验数据进行处理。结果　口服试验制剂甲钴胺胶囊和参比制剂后的ρmax分别为(511·30± 172·71)和(580·15±194·46) ng·L-1;血清中甲钴胺浓度增加量的△ρmax分别为(192·10±58·44)和(235·35±90·33) ng· L-1;tmax分别为(4·33±2·61)和(4·55±2·94)h;t1/2分别为(18·09±5·56)和(19·26±7·56)h;△AUC0–t分别为(5 566·35±2 620·19)和(5 411·78±2 676·79) ng·h·L-1,△AUC0–∞分别为(6 724·17±2 098·16)和(6 324·02±1 978·00) ng·h·L-1; 口服甲钴胺试验制剂后相对生物利用度F0–t和F0–∞分别为(106·49±28·90)%和(107·81±26·10)%。经拟合,口服甲钴胺制剂后其血药浓度-时间数据符合权重因子为1/C2的口服二室模型。结论　本试验建立的甲钴胺人体内血药浓度的测定方法简便、可靠,测定灵敏度高,试验制剂甲钴胺胶囊和参比制剂生物等效。关键词:化学发光微粒子免疫法;甲钴胺;药动学;生物等效性

　甲钴胺(mecobalamin)是一种周围神经障碍治疗药物,是维生素B12的甲基衍生物,临床主要用于治疗糖尿病神经障碍及多发性神经炎等周围神经疾病,也用于治疗因缺乏维生素B12引起的巨红细胞性贫血。与其他维生素B12相比,甲钴胺对神经组织具有更好的传递性,在体内通过甲基转换反应可促进神经细胞内的核酸-蛋白质-脂质代谢以及神经髓鞘的合成,修复被损害的神经组织,改善代谢障碍。此外甲钴胺还可以抑制神经组织传导的异常兴奋,促进正红血母细胞的成熟与分裂,促进血红素的合成, 改善贫血者的血象[1-3]。甲钴胺制剂的主药含量为每片500μg,给药后体内血药浓度极低( ng·L-1级),很难用一般的方法进行检测。本试验建立了甲钴胺血药浓度的化学发光微粒子免疫测定方法(chemiluminescentmicrop- article immunoassay,CMIA),并对甲钴胺胶囊的生物等效性进行研究。目前国内外尚未见有关于该方法测定甲钴胺人体内血药浓度的报道。

　1　材料与方法

　1·1　仪器 ARCHITECTTMi2000SR(ABBOTT LABORATO- RIES,USA);YKH-Ⅱ型液体快速混合器(江西医疗器械厂); KQ-50型超声清洗仪(上海超声波仪器厂);TGL-16C型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

　1·2　药品和试剂甲钴胺标准对照品(北京市福瑞康正医药技术研究所,纯度99·2%,批号: 030611); B12试剂盒(批号: 11001M300);B12Controls(批号: 10845M100);B12 MasterCalibrators(批号: 04444M100);预激发液(批号: 05454M100);激发液(批号: 06725M100);清洗液(08317M102),美国雅培制药有限公司生产。试验制剂:国产甲钴胺胶囊(500μg,福建华海药业有限公司,批号: 030301;参比制剂:弥可保[500 μg,卫材(苏州)制药有限公司,批号: 020173]。

　1·3　受试者选择本试验经国家食品药品监督管理局批准,试验方案经北京大学第三医院伦理委员会批准。20名健康成年男性志愿者经全面体格检查,心电图、血压、血尿常规及肝肾功能等各项指标均正常;受试者年龄(22·7±1·4)岁,身高(1·72±0·06)m,体重 (63·6±5·9)kg。受试者均无吸烟、饮酒史,受试前两周内未服用过任何药物,各受试者均自愿参加试验并于试验前由本人签署知情同意书。

　1·4　给药方法与样本采集本试验采用2制剂、2周期的随机交叉给药方案。入选受试者于每周期试验前1 d晚入住Ⅰ期病房,禁食过夜后于次日清晨,以200 mL温水送服单剂量1 500μg的甲钴胺试验或参比制剂。分别于服药前及服药后0·5, 1, 1·5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24, 48及72 h各采取前臂静脉血4 mL,静置2 h后 4 000 r·min-1离心10 min,分离血清置-40℃冰箱保存待测。在整个试验过程中样品注意避光,以避免药物降解。试验期间受试者进统一饮食。给药后2 h进早餐、给药后4 h进午餐、给药后10 h进晚餐,给药后 2 h后可自由饮水。受试者在试验期间禁烟、酒;禁服含咖啡因、可可碱、茶碱的饮品;禁食含B12的动物性食品,如肉、蛋、牛奶;禁止剧烈运动。

　1·5　甲钴胺血药浓度测定方法的建立

　1·5·1　血清样品的处理　定量移取血清样品 300μL至反应杯,加入包被内源性因子的磁性微粒子进行结合;用清洗液清洗后,加入吖啶共轭物、预激发液和激发液进行免疫反应;将反应液用ARCHI- TECTTMi2000SR进行测定。

　1·5·2　甲钴胺标准曲线的制备　吸取0, 100, 250, 500,1 000, 2 000 ng·L-16个质量浓度的标准液置样品杯中,按血清样品处理程序操作,于ARCHI- TECTTMi 2000SR分析仪中测定。ARCHITECTTMi 2000SR采用4-参数对数转换法(4PLC)及线性转换 (LT)技术建立标准曲线,标准曲线经B12Controls和 MasterCalibrators校准,通过程序处理判断标准曲线是否合格,若合格则存储该标准曲线,并以此对未知样品进行测定。

　1·5·3　方法精密度和准确度　分别配制低、中、高 (200, 400, 800 ng·L-1)3种质量浓度的血清质控样品,按标准曲线方法分别于日内和日间处理测定, 并计算日内和日间相对标准偏差,评价方法精密度。 同法配制低、中、高3种质量浓度的血清样品,按标准曲线方法分别处理测定,计算其回收率,评价方法准确度。

　1·5·4　样品稳定性试验　取口服甲钴胺制剂后采集的受试者血清样品于室温避光放置,按标准曲线方法分别于0, 2, 6, 9 h测定,考察样品的稳定性。 1·5·5　方法质量控制　在每批血清样品测定时建立新的标准曲线,并于每日测定样品时平行测定低、中、高(200, 400, 800 ng·L-1)3种质量浓度的质控样品,质控样品数大于被测定样品总数的5%。

　1·6　数据处理将受试者口服单剂量1 500μg的甲钴胺试验或参比制剂后的血药浓度列表,计算血清中甲钴胺浓度增加值(△ρ),并绘制平均血药浓度(△ρ)-时间曲线。计算每1个受试者的有关药动学参数,并求出参数的平均值及标准差。相对生物利用度F 用各受试者的△AUC0-t和△AUC0-∞分别计算,并求其平均值和标准差。F0-t= [(△AUC0-t)T/ (△AUC0-t)R]×100%;F0-∞= [(△AUC0-∞)T/ (△AUC0-∞)R]×100%。用3P97软件对受试者血清中甲钴胺浓度增加值(△ρ)-时间数据进行处理, 分析甲钴胺在人体内的药物动力学特征。将△AUC和△ρmax数据进行对数转换,然后进行方差分析及双单侧t检验处理,tmax用非参数检验进行统计分析,对甲钴胺试验制剂与参比制剂的生物等效性进行评价。

　2　结　果

　2·1　甲钴胺血药浓度测定标准曲线甲钴胺血药浓度测定后经B12Controls和Master Calibrators校准合格,符合测定要求,ARCHITECTTM i2000SR将试验制备的标准曲线自动存储,结果见表 1。本试验建立的标准曲线线性范围为100~2 000 ng·L-1。

　2·2　方法精密度和准确度甲钴胺血药浓度测定方法的精密度和准确度结果见表2。结果表明,本试验建立的甲钴胺血药浓度化学发光微粒子免疫测定方法准确、可靠。

　2·3　稳定性试验及质量控制甲钴胺血清样品室温避光放置时,在9h内测定结果的RSD为7·16%,结果表明,血清样品在本试验测定过程中稳定。本试验在测定过程中,于每日平行测定低、中、高浓度的质控样品,质控样品的测得值均在其真实值的±20%范围内。

　2·4　血药浓度-时间曲线将测得的给药后血清中甲钴胺浓度减去给药前血清本底中的B12浓度,即得口服甲钴胺制剂后的血药浓度(△ρ)。经研究,口服单剂量1 500μg的甲钴胺试验或参比制剂后平均血清药物浓度(△ρ)-时间曲线见图1。

　2·5　药动学隔室模型的拟合本试验采用简单平均数据法(na ve average data, NAD)将给药后每个时间点的各个个体的血药浓度数据进行平均作为主数据,然后用3P97软件进行隔室模型拟合,根据AIC值、r2和拟合优度等拟合结果进行判断。结果表明,甲钴胺口服给药后其血药浓度- 时间数据符合权重因子为1/ρ2的口服二室模型。

　2·6　有关药动学参数根据血清中增加的甲钴胺的血药浓度(△ρ)-时间曲线末端直线部分的试验点,以ln(△ρ)对t进行回归,求得消除速率常数ke;ρmax、△ρmax、tmax为试验的实测值;用梯形面积法计算样品的△AUC0–t, △AUC0–∞,△AUC0–∞=△AUC0–t+△ρt/ke,有关的药动学参数见表3。

　2·7　生物等效性评价单剂量口服试验和参比甲钴胺制剂后的 △AUC0-t、△AUC0–∞和△ρmax经对数转换后进行方差分析,结果表明本试验中处方间和周期间均无显著性差异,个体间有显著性差异;再采用双单侧t检验法对试验制剂与参比制剂的生物等效性进行评价,结果见表4。采用SPSS软件对口服甲钴胺试验和参比制剂后的tmax进行Mann-Whitney秩和检验, 结果表明,两种制剂的tmax没有显著性差异。由统计分析结果可知,试验和参比甲钴胺制剂生物等效。

　3　讨　论甲钴胺的测定方法主要有微生物分析法、化学分析法和色谱法[4-6],但能真正用于测定给药后血药浓度的方法却很少。其中微生物分析法不能很好的区分甲钴胺及其类似物,可能使测定结果偏高,过程中影响因素较多;现有的甲钴胺化学分析方法和色谱法主要用于体外研究,但由于甲钴胺制剂中主药含量仅为每片500μg,口服该制剂后,血清中的药物浓度最高仅几ng·L-1,最低甚至到几十ng· L-1,化学分析方法和色谱法很难进行测定。且正常人血清中存在着B12,这都给甲钴胺血药浓度的测定带来很大的困难。笔者曾建立了一种免疫测定技术微粒子捕捉酶免法(MEIA)[7]用于测定甲钴胺的血药浓度,该法系利用微粒内因子与待测物形成微粒内因子复合物后,与碱性磷酸酶共轭化合物结合成微粒内因子共轭复合物,再与底物反应生成带荧光的产物而被测定,研究结果表明,该法是一种快速、简便、特异性强、准确和灵敏度高的检测方法。但目前该法用于测定的有关试剂无法得到,因而本试验建立了另一种甲钴胺血药浓度的检测技术。试验建立的化学发光微粒子免疫测定方法(CMIA)是一种基于免疫反应原理,经反应产生化学发光而进行测定的高灵敏检测方法。

　试验的结果表明,化学发光微粒子免疫测定法是一种快速、简便、特异性强、准确和灵敏度高的检测方法,可以用于给药后生物样品的测定。国内有文献报道[8]采用全自动免疫化学发光分析法(AICS)测定人血清中甲钴胺浓度,该法也是一种灵敏、准确的检测方法。本试验建立的CMIA 测定方法与AICS相比,有以下的区别:本法与AICS 法所用的仪器、检测试剂和反应原理不同;本法标准曲线的线性范围(100~2 000 ng·L-1)较AICS法 (100~1 200 ng·L-1)更宽,可测定生物样品的浓度范围更广;本法样品处理更简单,AICS法需要在加入二硫代苏糖醇和氰化钾后,再将血样在100℃ 煮沸15~20 min,方能进行下一步反应,操作较为繁复,本试验建立的测定方法不需要进行这样的样品前处理,更具有方便、快捷的特点。