HIF和VEGF在低氧性肺动脉高压中的调控作用_药学论文

    【摘要】  目的:观察低氧诱导因子-1α(hif-1α)蛋白和血管内皮生长因子(vegf)蛋白在低氧性肺动脉高压小鼠肺内的表达,探讨hif和vegf在其中的调控作用。方法:建立低氧性肺动脉高压小鼠模型,spf级雄性c57bl/6小鼠16只,随机分为正常对照组(c组),低氧、高二氧化碳4 w组(h组),每组8只。测二组小鼠的右心室收缩压(rvsp)和右心室重量比rv/(lv+s)。光镜下观察右心室和肺组织病理学改变。应用免疫组化技术检测肺细小动脉上hif-1α蛋白和vegf蛋白的表达。结果:h组小鼠rvsp明显高于c组,且rv/(lv+s)亦有增加。光镜下肺细小动脉管腔变窄管壁增厚,中膜平滑肌细胞肥大增生。免疫组织显示:h组小鼠肺细小动脉hif-1α蛋白和vegf蛋白免疫组化吸光度高于对照组;vegf蛋白与hif-1α蛋白表达呈正相关。结论:慢性低氧使hif-1α蛋白和vegf蛋白在肺细小动脉表达增加,二者参与小鼠肺动脉高压的形成和发展过程。
    【关键词】  低氧诱导因子-1α 血管内皮生长因子 肺动脉高压 慢性低氧 高二氧化碳 小鼠
    abstract:  objective:to explore the expression of hypoxia-inducible factor 1α(hif-1α)protein and vascular endothelial growth factor(vegf) protein in mice with pulmonary hypertension induced by chronic hypoxic hypercapnia, and investigate whether hif signal path to regulate the expression of vegf. methods: sixteen male c57bl/6 mice were randomly divided into two groups: the control group (group c) and the group with hypoxic hypercapnia for 4 weeks (group h). the right ventricular systolic pressure (rvsp) and the ratio of rv/(lv+s)) were measured. lung sections were stained with hematoxylin and eosin (h&e) for morphologic studies under light microscope. the expression of hif-1αprotein and vegf protein of pulmonary arterioles was also observed with immunohistochemistry. results: ①the values of the rvsp, rv/lv+s in group h were significantly higher than that in group c. ②the vessel walls of the pulmonary arterioles of group h were thicken, the smooth muscle cells in tunica media were proliferated and the lumens of the pulmonary arterioles were narrowed under light microscope. ③both hif-1αprotein and vegf protein staining were positive in the lung of pulmonary arterioles of group h with immunohistochemistry. the average optical density of hif-1αand vegf protein with immunohistochemistry in the pulmonary arterioles in group h was significantly higher than that in group c. there was positive correlation between vegf protein and hif-1α protein. conclusion: hif-1αprotein and vegf protein are induced to express by chronic hypoxic, and involved in the pathogenesis with pulmonary hypertension in mice.
    key words:   hif-1α; vegf; pulmonary; hypoxia; hyperoapnia; mice
    慢性阻塞性肺疾病(chronic obst ructive pulmonary disease copd)是一种具有气流受限特征的疾病,随着病情的进展,长期慢性低氧可导致肺血管广泛收缩和肺动脉高压,常伴有血管内膜增生,血管发生纤维化和闭塞,造成肺循环的结构重组,最终导致右心衰竭。本实验采取常压下直接吸入低氧、高二氧化碳混合气体的方法,建立肺动脉高压小鼠模型,观察低氧诱导因子-1α(hif-1α)蛋白和血管内皮生长因子(vegf)蛋白在小鼠肺内的表达,并探讨hif和vegf在其中的调控作用。
    1  材料和方法
    1.1  材料  spf级雄性c57bl/6小鼠16只,体重23~27 g,温州医学院实验动物中心提供。兔抗小鼠多克隆抗体vegf、hif-1α以及sabc试剂盒均购自武汉博士德工程有限公司,其余均为市售分析纯试剂。
    1.2  模型复制  小鼠随机分为对照组(c组)、低氧高二氧化碳4 w组(h组),每组8只。将h组小鼠置于常压低氧、高二氧化碳动物饲养舱内,每天8 h,每周6 d,连续4 w,维持舱内氧浓度在9%~11%之间,二氧化碳浓度为5%~6%,复制慢性低氧、高二氧化碳肺动脉高压模型;对照组小鼠吸入空气,其他条件与低氧、高二氧化碳组相同。
    1.3  右心室有关指标检测  动物饲养到各相应时间点后,用戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,参照yanli song等报告的右心导管插入术,用1.4f标准的millar超微压力导管(型号为spr-835)连接medlab信号采集处理系统测右心室收缩压 (right ventricular systolic pressure rvsp)。测压后开胸取心,剪去心房组织,再沿室间隔剪开,将右心室(rv)和左心室加室间隔(lv+s) 分离,用滤纸吸干血液后分别称重,以rv/(lv+s)重量比作为评价右心室肥大指标。
    1.4  肺细小动脉显微结构观察  取右心室和肺组织,用4 ℃4%多聚甲醛固定4 h,然后脱水、石蜡包埋、切片,he染色,光镜下观察其病理学改变。
    1.5  肺细小动脉hif-lα、vegf的免疫组化检测  采用链霉亲和素-素复合体法(sabc 法)。一抗:兔抗小鼠多克隆抗体hif-lα和vegf,1:150稀释。操作步骤参照说明书的方法,稍有修改。每只小鼠任选2张肺组织切片,每张切片随机选取直径50~150μm的肺细小动脉2条,用图像分析软件(image-pro plus)测取所选血管管壁平均吸光度值(average optical density,aod)作为肺动脉管壁hif-lα和vegf的相对含量。
    1.6  统计学处理方法  两样本均数比较采用t检验。两变量的相关分析用直线相关分析法分析。
    2  结果
    2.1  两组小鼠rvsp和rv/(lv+s)的比较由表1可以看出,h组小鼠右心室收缩压明显高于c组,且右心室重量亦有增加。
    2.2  心脏和肺脏的病理学改变  光镜下,可见c组小鼠肺细小动脉管壁薄,平滑肌层未见明显增生,管壁均匀一致(见图1)。h组小鼠右心室肥厚且肺内血管壁明显增厚,肺细小动脉中膜平滑肌细胞(smc)增多,中膜(pamt)增厚,管腔变窄(见图2)。
    2.3  各组小鼠肺细小动脉hif-la蛋白,vegf蛋白免疫组化结果的比较  免疫组化表明,h组小鼠hif-1α蛋白和vegf蛋白阳性表达主要位于肺细小动脉平滑肌细胞,肺泡上皮细胞及细支气管上皮细胞,胞浆均呈阳性(见图4和图6),c组多数阴性表达表达(见图3和图5),h组的小鼠肺细小动脉血管壁hif-lα蛋白和vegf蛋白aod值高于c组p<0.01(见表2)。
    2.4  直线相关分析  小鼠肺动脉管壁中的hif-lα蛋白表达与vegf蛋白表达的aod值之间呈正相关(r=0.742,p<0.01;n=16)。
    3  讨论
    多年来,众多学者对低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,hph)的发生机制进行了深入的研究,目前认为hph 的形成主要与早期的低氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction,hpv)和后期的肺血管重建(pulmonary vascular remodeling,pvr)有关。
    已有研究发现低氧诱导因子和血管内皮生长因子在肺动脉高压形成中起重要作用。yu等发现hif-1α杂合性缺失小鼠在10%低氧3 w后与野生型小鼠相比,野生型小鼠形成肺动脉高压、右心室肥大和肺小动脉肌化,而杂合子小鼠上述病变的形成显着受阻。tuder等观察到在发生严重肺动脉高压的患者中,肺血管内皮出现从集状损伤,免疫组化和原位杂交显示hif-1α与vegfmrna表达增加。
    同时,肺组织在慢性低氧条件下,引起vegf表达增加。helen等研究表明,暴露于10%低氧环境达到1~3周时,大鼠肺组织vegf mrna显着升高,同时发现vegf蛋白在平滑肌细胞、肺血管、肺泡和细支气管上皮均呈强阳性表达,而且如果缺乏hif-1的表达,vegf mrna水平显着降低;即使在低氧条件下,vegf mrna也未被诱导表达。
    本实验结果显示:在低氧高二氧化碳环境下,小鼠的右心室压rvsp明显增高,右心室重量比 rv/(lv+s)也明显增加;光镜下呈现右心室肥厚和肺血管壁肌层增厚和管腔狭窄,这表明已成功建立低氧性肺动脉高压小鼠模型[7]。同时,应用免疫组化技术检测发现,肺细小动脉上hif-1α蛋白和vegf蛋白均呈阳性表达,而且肺血管壁越厚,hif-1α蛋白和vegf蛋白表达越强烈,说明二者参与肺血管构形重建,进而形成肺动脉高压。但有关低氧如何诱导hif-1α蛋白和vegf蛋白表达等尚有待进一步研究。
    【参考文献】
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