人血浆非对称性二甲基精氨酸浓度的RP-HPLC测定法_药学论文

    【摘要】  目的:建立一种测定人血浆中非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,adma)浓度的反相高效液相色谱法(rp-hplc)。方法:采用 waters symmetry c18柱(5μm,3.90 mm×150 mm),以0.05 mmol/l乙酸钠(ph6.8)为流动相a,甲醇为流动相b,线性梯度洗脱:14% 15 min,31% 25 min,45% 5 min(v/v/v),流速1.0 ml/min,荧光检测,激发波长330 nm,发射波长450 nm,邻苯二甲醛(opa)进行柱前衍生,室温下检测。结果:adma在0.05~5μg/ml范围内有良好线性关系,最小检出量为0.05μg/ml,平均相对回收率为(93.76±2.57)%,日内、日间平均变异系数分别为(3.25±1.59)%、(4.60±1.37)%。结论:本方法准确、简便、快速,适用于研究和临床检测。
    【关键词】  非对称性二甲基精氨酸 色谱法 反相高效液相
    血浆中非对称性二甲基精氨酸(asymmetrical dimethylarginine,adma)浓度变化与心血管疾病发生发展密切相关,近年来研究显示adma升高是一种新的心血管病危险因素。关于血浆中adma浓度的检测方法,国外虽已有报道[2,3],但操作繁琐,干扰因素多。国内曾有采用正相色谱法的报道。本研究在国内外同类研究的基础上适当改进,采用反相色谱法,用一元线性梯度洗脱,建立一套准确、简便、快速的高效液相色谱法检测人血浆中adma浓度的方法,报告如下。
    1  材料
    1.1  试剂  amda标准品、衍生剂opa、3-巯基丙酸均购自sigma公司,hplc分析纯度>99.99%;甲醇为一级色谱纯,购自天津市四友医药科技有限公司;硼酸为一级色谱纯,购自上海试剂总厂;乙酸钠、冰乙酸、氢氧化钾、5-磺基水杨酸为分析纯,购自上海试剂总厂。 超纯水(18.25 mΩ·cm)。
    1.2  仪器与设备  高效液相色谱仪为agilent1100系列,包括g1322在线脱气机、g1311a四元泵、g1316a柱温箱、g1321a fld荧光检测器;自动进样器;agilent工作站(reva.08.03.[847])。 高速离心机(tgl-16g,上海安亭仪器厂出品);漩涡混合器(xw-80a,上海医科大学仪器厂生产);电子分析天平(ab204-a,上海梅特勒-托利多仪器公司灵敏度0.1 mg);超纯水制备机(杭州永洁达净化科技有限公司生产)。
    1.3  amda工作液配制  准确称取adma标准品10 mg于100 ml容量瓶中,用超纯水溶解并定容,得浓度为100μg/ml adma储备液。再用超纯水依次稀释为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的adma工作液,贮存于4 ℃备用。
    1.4  流动相a配制  精密称取乙酸钠4.1 g,用重蒸水溶解后,在1000 ml容量瓶中定容,用2 mol/l冰乙酸调节ph值到6.8,即得浓度为0.05μmol/l,ph6.8的乙酸钠溶液,然后用0.45μm 滤膜过滤,超声脱气。
    1.5  opa衍生剂配制  精确称取opa 20 mg,加400μl的甲醇,0.2 mol/l硼酸3.6 ml(ph=9.5),3-巯基丙酸20μl,混匀避光(现配,现用)。
    2  方法和结果
    2.1  色谱条件  色谱柱:waters symmetry c18柱(5μm,3.9 mm×150 mm),保护柱:waters symmetry c18 保护柱(5μm,3.9 mm×20 mm);流动相:a为0.05μmmol/l乙酸钠(ph6.8),b为甲醇,按b 14% 15 min,31% 25 min,45% 5 min(v/v/v)梯度洗脱;进样量20μl;流速1.0 ml/min;柱温40 ℃;荧光检测波长:激发波长330 nm,发射波长450 nm。
    2.2  血浆样品处理方法  于1.5 ml离心管(ep管)中精密加入待测血浆1.0 ml,加入20 mg 5-磺基水杨酸,漩涡混匀5 min,冰浴15 min,于12000 r/min 离心10 min,吸取上清液。
    2.3  样本柱前衍生  取“2.1”中上清液100μl,加opa衍生剂100μl,漩涡混匀避光2 min后,上机,自动进样检测,色谱图见图1,可见血浆中adma峰形良好,分离完全,无杂质峰干扰。
    2.4  标准曲线的制备  于7支1.5 ml离心管中依次加入不同量的不同浓度的amda工作液,再各加入人空白血浆,配成终浓度依次为0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml的血浆标准品溶液系列。 再按血浆样本处理方法处理后分别测定,并记录色谱图,以峰面积为纵坐标,adma浓度为横坐标进行线性回归,得直线回归方程area=60.90027848×amt+3.5852958,r=0.99973,最小检出量0.05μg/ml,其含量在0.05~5.0μg/ml之间有良好的线性关系。
    2.5  精密度试验  按“2.3”项分别配制浓度为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml的血浆标准品溶液。按血浆样本处理方法处理后,日内衍生5次,隔日再衍生5次,分别计算日内变异和日间变异。结果见表1。
    2.6  回收率试验(相对回收率) 按“2.3”项分别配制浓度为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml的血浆标准品溶液。再按血浆样本处理方法处理后测其浓度,以实测浓度与配制浓度之比乘以100%计算adma的相对回收率,重复试验5次。结果见表2。
    3  讨论
    本研究方法在国内外同类研究的基础上进行了适当改进,采用线性梯度洗脱。线性梯度洗脱能缩短分析时间,提高分离度,改善峰形,提高检测灵敏度等。本研究中adma出峰干净,形态良好、对称,但出峰时间较其他文献报道[3,4]却有所延长。这同血浆样本处理方式有很大的关系,国外同类研究对血浆样本采用固相萃取分离,因此出峰可不考虑血浆中其他杂质影响,而国内同类研究受实验条件的限制,对血浆样本仅采用血浆蛋白沉淀法,因此需排除血浆中其他杂质的影响。本研究采用5-磺基水杨酸血浆蛋白沉淀法,血浆蛋白沉淀较完全,但一开始杂质峰仍较多,因此采用线性梯度洗脱,调整出峰时间至19~20 min,以减少杂质峰的干扰,结果显示adma目标峰出峰良好,形态对称。
    本研究建立的血浆adma浓度rp-hplc检测方法,采用opa柱前衍生、线性梯度洗脱,具有快速、简便、色谱峰形佳,结果准确可靠等优点,血浆中adma最低检测浓度为0.05μg/ml,精密度和相对回收率均符合等效性指导原则的要求,而文献报道称健康人血浆adma水平是(1±0.1)μmol/l(0.275±0.028μg/ml),因此本方法适用于科研试验研究和临床检测。
    【参考文献】
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