肝阳上亢型高血压模型及评价初探_药学论文

    【摘要】    为更好的应用于疾病实验研究,预期达到病症结合的目的,对肝阳上亢型高血压模型的建立方法进行并对其评价指标予以归纳和探索。
    【关键词】  肝阳上亢 高血压 模型 评价
    abstract:in order to better serve disease experimental research and reach forecasted combination of disease and symptoms, it sums up the establishment of hypertension model of hyperaction of liver yang, and makes exploration and induction to its evaluation index.
    key words:hyperaction of liver yang; hypertension; model; evaluation
    从历年来文献中报道过的具有“病证结合”特征的高血压肝阳上亢证动物模型,并其评价指标——症状和体征、组织学检查、相关生化指标和神经递质检测和方药测证。
    1  模型的建立
    1.1  黄文权等采用多巴胺静脉注射法模拟肝阳上亢证实验动物模型,并以生理盐水作为对照,方法简便易行,是国内外公开报道的首例,但该模型维持时间短,各观测指标均于停药3~4d后完全恢复正常,因而其应用受到很大限制。
    1.2  肖纯等采用双肾双夹加灌附子汤复制的高血压肝阳上亢证模型,基本符合肝阳上亢证的病因病机,且出现了类似肝阳上亢证临床表现,如眩晕、口渴、烦躁易怒等症状和血浆去甲肾上腺素(ne)、肾上腺素(e)显着升高,脑干ne明显增高等神经递质指标,该模型具有“疾病”、“证状”、“病理生理”结合特征,但手术损伤较大,容易造成动物死亡。
    1.3  鄢东红等选用自发性高血压大鼠(shr)加灌单味附子汤4周,造成高血压肝阳上亢证模型。附子乃辛甘大热之品,能温一身之阳,久用必耗伤精血,夺肝肾之阴而致肝肾阴虚,阴不潜阳而肝阳偏亢,因此采用灌服附子汤4w的方法是依据肝阳上亢证的病因病机设计的。shr肝阳上亢证模型具有血压稳定升高、易激惹程度增加、饮水量增加、旋转时间缩短、痛阈降低、肾小动脉硬化等近似人类高血压病肝阳上亢证的特征。是一种操作简单,重复性好,具有“病”“证”结合特征的动物模型。这种模型建立的方法,被模仿的最多,但shr的价格比普通的大鼠高近10倍。
    1.4  何纲等采用慢性束缚应激法结合悬吊应激法造成肝肾阴虚证,用双肾双夹法制备肾血管性高血压。所有模型大鼠均血压明显升高;出现烦躁、易激惹、眼结膜深红、头晕、口渴、大便干结等症状或体征。束缚应激大鼠模型是一种心理性应激模型。中医学形神统一观认为,形受束缚则情志易郁怒,故理论上认为该模型符合人类肝气郁结病因病机。乔明琦等[7]对束缚应激大鼠的整体反应及疏肝理气中药疗效观察结果表明,该模型的中医证型为肝气郁结。包天桐研究表明,悬吊应激小鼠具有类似中医“肾虚证”的某些病理变化,可用于补肾药及其他补益药的研究。因此,本研究中对大鼠实施束缚加悬吊应激,试图模拟人类肝气郁结证→肝肾阴虚证的发生、发展过程。该模型能够部分模拟人类高血压肝阳上亢证的病因病机和发病特点。
    1.5  王钦茂[8]等采用温里药、麻黄碱和盐水复合法给大鼠造模,前者为“肝阳上亢”证所设,不能引起高血压;盐水则相反。又因麻黄属解表药,与证型不符而选用麻黄碱,它可升压又有拟交感作用,但单用时模型成功率较低,且动物死亡率高。三种因素综合应用后,大鼠除血压升高外,出现烦燥不安、易激怒、尖叫,同笼动物相互撕打、咬人等攻击行为,并且饮水量和排尿量增加,尿内儿茶酚胺类物质升高,具有交感采錾舷偎柚使δ茉銮勘硐,以及camp升高,及6餐前列腺素f1α/血栓素b2比例下降等三项主要指标的改变,与临床上基本一致。造模无需手术,其成功率约80%,时间为4周左右,此后血压趋向稳定。
    可见模型的建立基本可以归纳为以下两个方面,一方面是制造肝阳上亢模型的方法,包括①使用一种或几种温里药、②应激法、③儿茶酚氨类等具有拟交感作用的物质(多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素或者麻黄碱)的使用;另一方面是高血压模型获得的方法[9]。这方面的研究已经比较成型,主要种类有①肾性高血压模型;②内分泌性高血压模型;③神经原性高血压模型;④遗传性高血压模型。当这两方面相结合时,就获得了征型结合的肝阳上亢型高血压模型。
    2  模型的评价
    分成两方面,其一是对高血压模型的评价,国内外已广泛使用各种测量动物血压的仪器,测量和评价方法也比较成熟[9];其二是检测动物肝阳上亢模型的形成。
    2.1  临床具体症状指标及评定方法
    2.1.1  陈华德等[1012]中医辨证标准  参照《中医临床诊疗术语证候部分》(国家技术监督局1997年发布),主要证候为眩晕、头痛、面红目赤或面部烘热、烦躁易怒、口苦而渴、脉弦。具有以上6项中4项主症者,无或兼1~2项肝肾阴虚症状者即可辨为肝阳上亢证。这是被普遍肯定的评价方法。
    2.1.2  张亚东等[13]参考《实用中医内》所制定的辨证标准[14],通过临床观察及流行病学调查,参照现代医学的方法,将证候分为主症和次症两类,制定出肝阳上亢证的辨证标准。即主症:眩晕,头痛,面部烘热,烦躁或情绪易激动,脉弦;次症:口干苦,耳鸣,肢麻,失眠,舌红或绛,苔黄或腻,脉细数有力。认为在上述病症中若有4项主症合2项次症,或2项主症合3~4项次症,即可辨为肝阳上亢证。此法包括的症状较多但临床应用不多。
    2.1.3  陈国林等[15]制定的肝阳上亢证辨证标准为①眩晕;②头痛;③面部烘热;④烦躁易怒;⑤口苦而渴;⑥脉弦。以上6项中具有4项,无或兼有1~2项肝肾阴虚症状(记分不超过3分以便与肝肾阴虚证鉴别)辨证项记分超过10分。记分标准为:将症状程度分为无、轻、中、重、严重5级,分别记0、1、2、3、4分,无法记分的症状如味觉、面色等记有无,分别记1、0分,舌脉与证相符的记1分,不相符的记0分。此方法虽然选用记分的方法以求量化,但因为症状等级区分难以确定而不很实用。
    2.2  据上而拟定实验动物模型的筛选症状指标为:
    2.2.1  外观和性情变化(与其对应的人的症状为第④项烦躁易怒)
    2.2.1.1  外观  指毛色是否有光泽及双眼结合膜颜色是否加深变红[24,10,16]
    2.2.1.2  性情变化  根据文献报道的分类方法主要有3种,易激惹程度都分为3级。方法一[23,10,16]:Ⅰ级指捉持颈部时尖叫、惊跳;Ⅱ级指捉持颈部时咬人;Ⅲ级指提尾时尖叫、惊跳甚至咬人或同笼大鼠频繁打斗;方法二[7]:1级:喜跳跃;2级:在1级基础上加喜抓铁笼;3级:在2级基础上加咬人、咬铁笼。方法三[10]:Ⅰ级指活动增加、经常有跳跃和咬铁笼行为;Ⅱ级指在Ⅰ级基础上,兼有捉持颈部时尖叫、惊跳;Ⅲ级指在Ⅱ级基础上,兼有同笼大鼠频繁打斗行为。
    2.2.2  饮水量[2,4,10,16](与其对应的人的症状为第⑤项口苦而渴)每个鼠笼放大鼠1只,用相同容积的水瓶供水,24h前后水瓶重量的变化值即为每日饮水量。
    2.2.3  痛阈(与其对应的人的症状为第②项头痛)采用热板测痛法[10],热板温度为55.0℃±0.5℃,从大鼠放入开始到舔后足底/后脚爪或跳跃运动所经历的时间为痛阈。或采用尾电刺激法[17],用痛阈测量仪作方波脉冲电流刺激:频率8hz,波宽2ms,电压从零开始,由低到高直至大鼠出现嘶叫,以此时的电压值为痛阈。
    2.2.4  周围血管充盈(与其对应的人的症状为第③项面部烘热)分为Ⅲ级:Ⅰ级:双耳及头颈部毛细血管充盈,Ⅱ级:在Ⅰ级基础上加躯干部毛细血管充盈,Ⅲ级:在Ⅱ级基础上加四肢毛细血管充盈,腹壁静脉轻度怒张。
    2.2.5  心脏血流动力学测定[18]其中的心率即脉搏数(与其对应的人的症状为第⑥项脉弦)氨基甲酸乙酯ip麻醉,分离右侧颈总动脉,插入充满肝素生理盐水导管至左心室,另股动脉插管测血压。联压力换能器,同步输入多功能信号处理系统。记录心率(hr)、收缩压(sap)、舒张压(dap)、左室压(lvsp)、左室最大变化速率(±dp/dtmax)、左室舒张期末压(lvedp)等指标。此外,经颅多普勒检测大脑中动脉平均血流速度、收缩峰血流速度增高。高血压肝阳上亢证白天血压高于夜间[16]。
    2.2.6  旋转时间(与其对应的人的症状为第①项眩晕)根据文献[24,19]方法自制旋转平台,将大鼠置于旋转平台上,分3次每隔10s调速1次,转速分别为15、30、45r/min,记录跌下时间,若2min仍不跌下则停止测试。
    2.2.7  其他  可以观察大便性状、舌象;尿量[8];心、肾脏器检测,计算脏器系数,并作肾脏病理组织学观察:先10%福尔马林固定,再石蜡包埋,切片(5lm),常规he染色,在光镜下观察有无肾入球小动脉硬化及肾小球萎缩等。
    2.2.8  模型的神经递质及生化指标
    为更加全面客观的评价模型,可以参考的神经递质及生化指标有。
    2.2.8.1  血浆ne、e及脑干ne、5睭t测定  肝阳上亢证最主要的病理生理基础为外周交感——肾上腺髓质功能偏亢[20],表现为血、尿儿茶酚胺增高,肖纯等实验发现肝阳上亢组模型大鼠出现与此相同的病理生理变化,血浆ne、e显着升高。脑内ne、5睭t的动态平衡与中枢痛阈的升降变化及情绪波动有密切关系[21]:当脑内ne明显升高和(或)5睭t明显下降时,将使痛阈明显下降造成头痛,并出现烦躁易怒、躁狂、攻击行为等,本模型大鼠脑内ne明显升高、5睭t明显下降,可能是肝阳上亢证发生头痛、烦躁易怒等证侯的重要机制。所有动物均于实验第8周末断头处死,将血液在4℃3 000r/min离心15min,分离出血浆,放-80℃冰箱中保存待测,采血同时迅速剥离脑组织,分离出脑干放入液氮中冷冻1w,再转移至-80℃冰箱中待处理。
    2.2.8.2  血清睾酮、血浆肾素活性(pr睞)、血管紧张素ii(aii)、醛固酮  方药测证研究结果提示,肾血管狭窄高血压大鼠模型属肾阴虚型高血压,并发现大鼠血浆醛固酮水平增高[22]。本模型大鼠血浆醛固酮含量同样显着增高,为其存在阴虚证提供了客观依据。而肾阴虚是肝阳上亢两个成因之一,另一是肝阴虚。从悬吊应激导致小鼠性行为低下及血浆睾酮水平明显降低。模型大鼠血清睾酮含量也明显降低,说明该模型具有肾虚证的生化改变。同时,肾素活性和血管紧张素水平也显着增高,变化趋势相似。这些结果说明,该模型具有阴虚阳亢的病理基础。肾素—血管紧张素系统在机体的血压及水、电解质平衡的调节上起着重要的作用。黄文权等用多巴胺静脉注射方法制备兔肝阳上亢模型,发现模型兔血浆肾素活性和血管紧张素ii含量明显升高,说明pr睞及aii的升高可能为肝阳上亢证型的重要客观指标之一,可作为临床辨证的参考依据。本模型大鼠血浆肾素活性和血管紧张素ii含量也显着升高,与之符合。实验结果还显示,大鼠血浆去甲肾上腺素和肾上腺素水平显着升高,与双肾双夹加灌附子汤法制备的高血压肝阳上亢证大鼠模型[8]的变化趋势一致。血浆去甲肾上腺素主要血管交感神经末梢,血浆肾上腺素来自肾上腺髓质。我们推测,悬吊、束缚等强烈应激使大鼠交感神经兴奋,肾上腺髓质功能亢进,使肾上腺素释放增加,并导致肾素活性增强、血管紧张素水平增高,可能是本模型具有肝阳上亢证的重要生化基础。
    2.2.8.3  血清一氧化氮(nitric oxide,no)  no是血管内皮依赖的松弛因子,为主要的扩血管物质,它具有强大的舒张血管的作用,血管内皮细胞通过合成和释放no来维持和调节血管的舒张,保持血压的相对稳定。抑制no的基础释放,可引起外周血管收缩,导致血压升高。no生成减少,除可直接导致水钠潴留外,还可使血管内皮细胞的内皮源性收缩因子tax2、pgh2生成增多,对自由基的消除能力也减弱,过多的自由基引起脂质过氧化,从而参与高血压的发展。陈华德等[16]实验结果显示,模型对照组在造模成功后血压普遍升高,其血清no浓度亦显着低于空白对照组,可见血压与血清no浓度的相关性。运用硝酸还原酶法测定。no性质活泼,在体内很快转为no2埠蚇o3,而no3灿纸一步转化为no2,本法利用硝酸还原酶特异性将no3不乖为no2,通过显色深浅测定其浓度的高低。在第6周周末治疗结束后,采用摘除眼球法取血,取大约2ml血液于普通玻璃试管中,温度为4℃,3000r/min下离心15min,分离出上清液,待测。具体操作按说明书进行。
    2.2.8.4  尿内3布籽跎錾舷偎(tmn)、ne;血浆内环核甘酸(camp)、血栓素b2(txb2)、及6餐前列腺素f1α(6瞜睵gf1α)  一般认为交感神经、肾素血管紧张素系统对血压调节起着主要作用。儿茶酚胺、aⅡ、txb2具缩血管作用,而pgi2有扩血管作用。王钦茂等[8]的实验表明肝阳上亢型高血压动物主要出现尿内儿茶酚胺类物质tmn、ne升高,具有交感-肾上腺髓质功能增强表现,以及camp升高,6瞜睵gf1α/txb2比例下降等三项主要指标的改变,与临床上相一致。按各自的试剂盒说明书进行。camp用液体闪烁计数器测定,txb2、6瞜睵gf1α和aⅡ采用γ放免计数器测放射性计数(cpm)值。tmn含量用紫外分光光度法,ne测定根据shellenberger等方法。
    2.2.9  方药测证  选用临床用于治疗肝阳上亢型高血压的天麻钩藤饮进行验证。
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