RP睭PLC法测定兔血浆中黄芩苷的含量_药学论文

    【摘要】  反相高效液相色谱法; 黄芩苷; 血药浓度
    【关键词】  反相高效液相色谱法; 黄芩苷; 血药浓度
    abstract:objective a rapid sensitive rp睭plc method was developed to determine baicalin in the rabbits’ plasma. methods the rabbits' plasma was pretreated by precipitating with acetonitrile. diamonsoltm c18  column was used. the mobile phase was consisted of methanol, water and phosphate(55∶45∶0.2). the flow rate was 1.0 ml/min, and the uv detection was set at 277 nm. benzoic acid was used as internal standard.  results the linear calibration curves were obtained in the concentration range of 1~50μg/ml(r=09993). the within瞕ay and between瞕ay rsd were within 2.8% and 4.0% respectively,relative recovery rate and extraction recovery rate were 95.5% and 62.3% respectively.conclusions the method is simple, rapid and suitable for the determination of concentration of plasma and the study of pharmacokinetics.
    key words:baicalin ; rp睭plc;  concentration of plasma
    黄芩苷是从唇形科植物黄芩(scutellaria baicalensis  georgi)的干燥根提取所得的黄酮类物质,具有抗炎抗变态反应、抗微、解热、降压利尿、降血脂血糖、利胆解痉等作用[1~2]。黄芩苷是多种中药制剂的有效成分,因此建立黄芩苷的血药浓度测定方法,具有重要意义。本文在文献[34]基础上,进行测定条件优化,采用rp睭plc法,以苯甲酸为内标物测定家兔血浆中黄芩苷的含量,此方法具有简便、专属性强、准确及应用性强等优点,为研究其体内代谢提供方法依据。
    1  仪器与药品 
    lc10a型高效液相色谱仪(日本岛津公司);spd10avp紫外部杉分光光度检测器(日本岛津公司);hw2000色谱工作站。漩涡混合器(天津药典标准仪器厂);高速台式离心机(上海安亭仪器厂);超声波清洗器(天津恒奥超声波清洗器)。黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110715-200514),黄芩苷原料药(广州市亿深天然产物科技发展有限公司),内标物苯甲酸为分析纯(天津市大茂试剂厂),甲醇、乙腈为色谱纯(天津市四友医学技术有限公司),试验用兔子(购于广东省卫生厅实验动物中心)。
    2  方法与结果
    2.1  色谱条件 以文献中色谱条件为基础改进,色谱柱为diamonsoltmc18柱(250 mm×4.6 mm,id,5 μm);流动相:甲醇菜擦姿(体积比55∶45∶0.2);流速:1 ml/min;检测波长:277 nm;柱温:室温;进样量:10 μl。
    2.2  溶液的制备
    2.2.1  对照品溶液的制备  精密称取黄芩苷对照品25 mg,置50 ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,即得0.5 mg/ml 的黄芩苷对照品储备液。分别精密吸取黄芩苷对照品储备液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml分别置10 ml容量瓶中,用重蒸水定容,配成5 、25、50、100、150、200、250 μg/ml的系列黄芩苷对照品标准溶液。
    2.2.2  血浆样品处理取含有一定量黄芩苷的血浆0.4 ml至5 ml离心管中,加入重蒸水0.4 ml,内标物溶液(0.45 mg/l苯甲酸甲醇溶液)0.4 ml,乙腈0.8 ml,漩涡混合30 s,超声振荡5 min,于3 000 r/min的高速离心机上离心10 min,取上清液经0.45 μm微孔有机滤膜滤过,取续滤液10 μl进样,记录色谱图。
    a.空白血浆;b.空白血浆+20 μg/l黄芩苷+90μg/l苯甲酸甲醇溶液;c.血浆样品
    a.黄芩苷; b.苯甲酸
    图1  样品测定色谱图(略)
    fig.1  chromatograms of rat plasma samples
    2.3  方法的专属性取空白血浆0.4 ml,除不加内标物溶液外,按“2.2.2”项下操作,得色谱图1a,将一定浓度的黄芩苷标准液和内标物溶液加入空白血浆中,依法操作,得色谱图1b,待测物黄芩苷与内标苯甲酸的保留时间分别为9.8 min和11.7 min;取血浆样品,依同法操作,得色谱图1c。结果表明,空白血浆中的内源性物质不干扰待测物黄芩苷及内标物的测定。
    2.4  标准曲线和线性范围取空白血浆0.4 ml,加入黄芩苷标准系列溶液0.4 ml,配制成相当于黄芩苷血浆质量浓度为1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/ml,除不加入重蒸水0.4 ml外,按照“2.2.2”项下依法操作。进样10 μl,记录色谱图;以待测物质量浓度为横坐标,待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标,用最小二乘法进行回归运算,求得直线回归方程:y= 0085179x-0.00244,r= 0.999 3,表明黄芩苷质量浓度在1~50 μg/ml内呈良好的线性关系,定量下限为0.11 μg/ml。
    2.5  精密度与准确度取空白血浆0.4 ml按照“2.4”项下方法制备黄芩苷低、中、高3个浓度(5.0,50.0,250.0 μg/ml)的样品,每一浓度进行3样本分析,连续测定3 d,并与标准曲线同时进行。以当天的标准曲线计算样品的浓度,求得方法的精密度与回收率,结果见表1。
    表nbsp; 黄芩苷的准确度和精密度试验结果(略)
    tab.1  accuracy and precision of the hplc determination of baicalin
    2.6  提取回收率考察取空白血浆0.4 ml,按“2.4”项下的方法制备低、中、高3个浓度(5.00,50.0和250.0 μg/ml)的样品,每个浓度测定3个样品。同时另取空白血浆0.4  ml,除不加重蒸水外,按“2.2.2”项下处理,分取上清液,加入相应浓度的标准溶液0.4 ml,混匀,进样分析,获得相应的峰面积。以每一浓度2种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。结果表明,黄芩苷血浆浓度在5.00,50.0和250.0 μg/ml时的提取回收率分别为61.2%,635%,62.3%,内标溶液经同法提取处理,其提取回收率为64.8%。
    2.7  血浆样品的测定  取含有一定量黄芩苷的血浆0.4 ml,按照“22.2”项下进行操作,进行6个样本分析,测得血药浓度为17.96 μg/ml,rsd为2.1%。
    3  讨论
    3.1  内标物的选择根据文献[3-6]报道,选对硝基苯甲酸作内标物,测定结果与供试品峰重叠;另分别选水杨酸、苯甲酸作内标物,实验结果显示苯甲酸与供试品的分离度在1.5~20,符合要求,且在室温(15~30 ℃)柱效及分离度不受干扰。
    3.2  蛋白沉淀剂的选择  分别选用四氢呋喃、乙腈、甲醇作为蛋白沉淀剂及提取溶液,经提取回收率的比较,甲醇的提取率较低,而乙腈和四氢呋喃的效果相当;由于四氢呋喃对色谱测定有干扰,最后选择乙腈作为蛋白沉淀剂及提取液。
    3.3  本实验的方法准确,简单、灵敏,能满足样品分析的要求,为黄芩苷的血药浓度测定提供依据。
    【参考文献】
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