HPLC在测定血浆同型半胱氨酸含量中的应用_药学论文

    【摘要】  目的:探讨高效液相色谱法(hplc)在测定血浆同型半胱氨酸含量中的应用。方法:血浆同型半胱氨酸用邻苯二甲醛(opa)衍生,经hypersil aa睴ds色谱柱(2.1mm×200mm,5μm),用0.02 mol·l-1naac∶乙腈∶四氢呋喃=56∶43.8∶0.2的流动相洗脱,柱温40℃,检测波长330nm,流速1.3ml·min-1。结果:线性范围为0.48~31.25μg·ml-1,回归方程为a=27.167c+38.765,r=0.9962;平均回收率为98.61%,rsd=1.84(n=6),日内及日间相对标准偏差均小于5%。结论:该法准确、简便、快捷,适用于大多数实验室。
    【关键词】  同型半胱氨酸; 高效液相色谱法
    【abstract】  objective: to set up the method for determining the content of homocysteinein human plasma with hplc. methods: column was hypersil aa睴ds(2.1mm×200mm,5μm),using 0.02mol·l1sodium acetate acetonitrile睺etrahydrofuran(56∶43.8∶0.2) balanced solution as mobile phase and detective wavelength at 330nm,the fiowing speed was 1.3ml·min-1,and column temperature was 40℃.results: the calibration curve was linear in the range of 0.48 ~ 31.25μg·ml-1 and ,the linear correlation equation was a=27.167+38.765(r=0.9962)the average recovery rate was 98.61%,and rsd was between 1.84%(n=6). the standard relative difference within a day and between two days was lower than 5%. conclusion: the method is simple、accurate,and fast,which is suitable for the most lab test.
    【key words】  homocysteinein;hplc
    同型半胱氨酸(homocysteine,hcy)是一种含硫氨基酸,是蛋氨酸循环中s蚕佘栈高半胱氨酸水解酶水解反应的产物。研究表明, 血中 hcy 升高可致流产、新生儿缺陷、中风、老年性痴呆及其它老年性疾病如骨质疏松等,维生素b12及叶酸缺乏、心脑血管疾病等都可反映出血浆hcy浓度异常变化。血浆中hcy测定已成为国外诊断维生素b12及叶酸缺乏、早期心脑血管疾病监控疗效的常规方法。
    同型半胱氨酸的测定常用放射免疫法、荧光偏振免疫分析法及hplc法等[4~6]。本研究在参考有关文献的基础上,对色谱条件进行了适当的改进,使测定更加简便、快速,应用于实际样品测定,效果良好。
    1  仪器与试剂
    1.1  仪器  hp1100高效液相色谱仪(包括在线脱气机、四元泵、柱温箱、荧光检测器、工作站),分析天平(a/d,1/10万,日本)。
    1.2  试剂  衍生剂:50mg邻苯二甲醛(opa)溶于4.5ml甲醇中,再加入0.25mol·l-1硼酸缓冲溶液(ph=8.4)0.5ml,巯基乙醇50μl,避光保存。1 g·l-1hcy标准储备液:1mg hcy溶于1ml 0.045mol·l-1hcl溶液中。hcy标准品、邻苯二甲醛(sigma公司),甲醇、乙腈(色谱纯,天津科密欧试剂开发中心),巯基乙醇、冰乙酸、乙酸钠、四氢呋喃均为分析纯试剂。三蒸水为本实验室自制。
    2  实验方法
    2.1  色谱条件
    色谱柱为hypersil aa睴ds(2.1mm×200mm,5μm),流动相:0.02mol·l-1naac(ph=7.20)∶乙腈∶四氢呋喃=56∶43.8∶0.2,柱温:40℃,流速为1.3ml/min,检测波长330nm,进样量:20μl。
    2.2  标准曲线的制作
    以1g·l-1hcy标准储备液做不同倍的倍比稀释,分别取40μl于6支5ml具塞离心管中,分别加入40μl过氧化氢,室温放置30min后于70℃水浴中用氮气吹干,各加入30μl巯基乙醇和70μl衍生剂,4min后取20μl进样。回归方程为:a=27.167ca+38.765,r=0.9962,线性范围为0.48~31.25.00μg·ml-1。
    2.3  样品分析
    a:同型半胱氨酸
    图1  标准品(a)和血浆样品(b)的色谱图谱    取样品血浆0.5ml于具塞离心管中,加入0.5ml乙腈沉淀蛋白,离心后取上清液40μl于5ml具塞离心管中,分别加入40μl过氧化氢,室温放置30min后于70℃水浴中用氮气吹干,各加入30μl巯基乙醇和70μl衍生剂,4min后取20μl上机进样。色谱图见图1。表1  回收率结果 (μg·ml-1)
      样品量加入量测得量回收率(%)平均回收率(%)rsd(%)11.130.101.25101.6221.130.101.19 96.7431.130.351.46 98.6541.130.351.47 99.3251.130.601.68 97.1161.130.601.70 98.2798.611.84
    3  结果
    3.1  标准曲线和方法学评价
    对不同稀释度的hcy标准溶液进行衍生处理后测定,结果表明,hcy浓度在0.48~31.25μg·ml-1范围内,峰面积与浓度之间有良好的线性关系。
    在同一份已知含量的血浆样品中加入不同量hcy,测定方法的回收率。取3份浓度不同的血浆样本,分别测定日内及日间精密度,日内精密度为4.2%,日间精密度为4.4%,回收率结果见表1。
    3.2  色谱条件的影响
    用在测定血浆氨基酸的流动相的梯度条件下,测定hcy,尽管也能达到测定目的,但一个样品的测定周期达40min,难以进行批量样品测定。为此,本试验用0.02mol·l-1naac (ph=7.20)和乙腈、四氢呋喃不同比例的等梯度洗脱,发现在0.02mol·l-1naac(ph=7.20)∶乙腈∶四氢呋喃=56∶43.8∶0.2时等度洗脱可达到最好的分离效果,且在20min内即可完成一个样品测定。该方法准确、简便、快捷,适用于大多数实验室进行实验研究及临床检测。
    【参考文献】
    1 席荣英,孙祥德,齐伟,等.反相高效液相色谱法测定血浆中同型半胱氨酸的含量\[j\]. 分析学报,2003,19(4):352354
    2 fiskerstrand t,refsumh,kvalhein g,et al.homocysteine and other thiols in plasma and urine:automated determination and sample stability\[j\].clin chem,1993,39(2):263265
    3 沈佐君,吴琳.高效毛细管电泳法快速测定血清中游离氨基酸\[j\].中华医学检验杂志,1998,21(3):151154
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